اعتبارسنجی روش‌های آزمون: تعیین LOD/LOQ، خطیّت و تکرارپذیری

در دنیای آزمایشگاهی و تولید صنایع دارویی، غذایی و دامپزشکی، تضمین صحت و دقت روش‌های آزمون از اهمیت بالایی برخوردار است. اعتبارسنجی این روش‌ها، کلید حصول اطمینان از کیفیت نتایج، امنیت محصول و انطباق با استانداردهای بین‌المللی مانند ISO 17025، HACCP و GMP است. در این مقاله به بررسی فنی و تخصصی تعیین حد تشخیص (LOD)، حد تعیین‌پذیری (LOQ)، ارزیابی خطیّت و تکرارپذیری روش‌های آزمون می‌پردازیم که توسط آزمایشگاه‌های پیشرفته و کلین‌روم‌های تخصصی آزمایشگاهی انجام می‌شود.

مقدمه‌ای بر اعتبارسنجی روش‌های آزمون

اعتبارسنجی روش‌های آزمون فرآیندی نظام‌مند است که به منظور تضمین دقت، صحت و قابلیت اطمینان نتایج آزمایشگاهی انجام می‌شود. این مرحله حیاتی برای هر آزمایشگاه معتمد و خطوط تولید دارویی، غذایی و دامپزشکی است که ملزم به رعایت الزامات سیستم‌های مدیریت کیفیت و استانداردهای ایزو خواهند بود. در این فرایند، روش‌های کمی و کیفی آزمون مورد بررسی قرار گرفته و خصوصیات کلیدی آن مانند حساسیت، خطیّت و تکرارپذیری اندازه‌گیری می‌شود.

روش‌های رایج مورد استفاده در آزمایشگاه‌های مدرن شامل HPLC/LC-MS برای آنالیز ترکیبات پیچیده، ICP-OES برای فلزات سنگین، و qPCR برای شناسایی میکروبیولوژیکی است. در کنار این‌ها، روش‌های میکروبیولوژیکی مانند کشت و شمارش کلونی (CFU) در پلیت و ارزیابی شاخص‌های کیفیت نظیر SCC و SPC نیز از جمله آزمون‌های اعتبارسنجی هستند که در آزمایشگاه‌های مرتبط با صنایع دارویی و غذایی کاربرد گسترده دارند.

تعیین حد تشخیص (LOD) و حد تعیین‌پذیری (LOQ)

تعاریف و اهمیت LOD و LOQ

حد تشخیص (Limit of Detection – LOD) به کمترین مقدار آنالیت یا ماده‌ای که می‌توان حضور آن را با اطمینان تشخیص داد گفته می‌شود، بدون اینکه الزاماً مقدار دقیق آن مشخص شود. در مقابل، حد تعیین‌پذیری (Limit of Quantification – LOQ) نمایشگر کمترین میزان آنالیت است که می‌توان آن را به صورت کمی و با دقت قابل قبول اندازه‌گیری کرد.

در سیستم‌های مدیریت کیفیت مانند ISO 17025، تعیین دقیق LOD و LOQ برای روش‌های آزمون امری الزامی است، زیرا حساسیت بالای روش در تشخیص آلودگی‌ها یا ناخالصی‌های دارویی و مواد غذایی می‌تواند نقش مهمی در تضمین سلامت مصرف‌کننده ایفا کند.

روش‌های محاسبه LOD و LOQ

روش‌های متداول تعیین LOD و LOQ معمولاً شامل استفاده از سیگنال به نویز (S/N)، انحراف معیار و شیب منحنی کالیبراسیون است. برخی از رایج‌ترین روش‌ها عبارتند از:

• استفاده از سه برابر انحراف معیار سیگنال زمینه (Baseline Noise) برای تعیین LOD و ده برابر آن برای LOQ
• رسم منحنی کالیبراسیون و محاسبه LOD و LOQ بر اساس شیب منحنی و انحراف معیار پاسخ‌های کم‌غلظت
• استفاده از روش‌های آماری و آزمون‌های تکراری برای صحت‌بخشی نتایج

در آزمایش‌های HPLC/LC-MS که در آنالیز مواد دارویی و ویتامین‌ها کاربرد فراوان دارند، تعیین دقیق LOD و LOQ نقش کلیدی در تطابق با استانداردهای ISIRI و GMP دارد.

ارزیابی خطیّت روش‌های آزمون

مفهوم خطیّت و کاربرد آن

خطیّت (Linearity) عبارت است از توانایی روش آزمون برای ارائه نتایجی متناسب و خطی با غلظت یا میزان آنالیت در بازه‌ای مشخص. این ویژگی نشان می‌دهد که پاسخ دستگاه مانند HPLC یا سیستم ICP-OES تا چه حد با تغییر غلظت نمونه به صورت مستقیم متغیر است.

داشتن خطیّت مناسب، به ویژه در آزمون‌های کنترل کیفیت و آنالیز کمی، اهمیت بسزایی دارد چرا که عدم خطیّت می‌تواند منجر به خطاهای سیستماتیک و اشتباه در تعیین مقادیر نهایی شود. در سیستم‌های GMP و ISO 22000، مستندسازی نتایج خطیّت برای تایید اعتبار روش یکی از الزامات مهم است.

روش‌های بررسی خطیّت

خطیّت معمولاً با تهیه محلول‌های استاندارد با غلظت‌های مختلف و اندازه‌گیری پاسخ دستگاه در هر سطح انجام می‌شود. نکات کلیدی در این فرآیند شامل موارد زیر است:

• تهیه حداقل پنج سطح غلظتی در رنج مورد نظر
• اندازه‌گیری هر نمونه به صورت تکراری (معمولاً سه بار)
• محاسبه ضریب همبستگی (R²) که باید عددی نزدیک به واحد باشد (معمولاً بالای ۰.۹۹)
• بررسی باقی‌مانده‌ها (Residuals) برای شناسایی انحرافات احتمالی در نقاط مختلف

روش‌های آماری پیشرفته‌تر در سیستم‌های مدیریت کیفیت و ممیزی‌های ISO 17025 مورد استفاده قرار می‌گیرند تا از صحت و دقت این ارزیابی‌ها اطمینان حاصل شود.

تعیین تکرارپذیری و بازتولیدپذیری

تعریف تکرارپذیری

تکرارپذیری (Repeatability) به قابلیت حصول نتایج مشابه از یک روش آزمون در شرایط یکسان و کوتاه‌مدت اشاره می‌کند. به عبارت دیگر، اگر یک نمونه توسط همان اپراتور و دستگاه و در بازه زمانی کوتاه چند بار اندازه‌گیری شود، نتایج چقدر با یکدیگر همخوانی دارند.

این ویژگی برای کنترل کیفیت آزمایشگاهی، خصوصاً در خط تولید دارویی و غذایی، حیاتی است. تکرارپذیری بالا به معنای اعتمادپذیری نمونه‌برداری، روش اجرای آزمون و شرایط محیطی آزمایشگاه است. همچنین باید بین تکرارپذیری و بازتولیدپذیری (Reproducibility) تمایز قائل شد؛ بازتولیدپذیری شامل آزمایش‌ها در شرایط متفاوت (دستگاه، اپراتور، مکان) است.

روش‌های ارزیابی تکرارپذیری

برای تعیین تکرارپذیری، معمولاً چندین نمونه همگن از یک ماده استاندارد یا نمونه واقعی به صورت تکراری آزمون می‌شوند و معیارهای آماری زیر محاسبه و گزارش می‌گردد:

• انحراف معیار (Standard Deviation)
• ضریب تغییرات (Coefficient of Variation – CV)
• محدوده نتایج (Range)

استاندارد ISO 17025 و روش‌های GMP تاکید ویژه‌ای بر مستندسازی دقیق مراحل و نتایج تکرارپذیری دارند تا در ممیزی‌ها کیفیت روش‌ها به اثبات برسد.

نتیجه‌گیری و اهمیت اعتبارسنجی در کیفیت نتایج آزمایشگاهی

اعتبارسنجی روش‌های آزمون، از جمله تعیین حد تشخیص (LOD)، حد تعیین‌پذیری (LOQ)، ارزیابی خطیّت و تعیین تکرارپذیری، بنیان کیفیت و اعتمادپذیری نتایج آزمایشگاهی در صنایع دارویی، غذایی و دامپزشکی است. این فرآیند سبب می‌شود که آزمایشگاه‌ها و خطوط تولید به استانداردهای بین‌المللی نظیر ISO 17025، ISO 22000، GMP و HACCP پایبند باشند و انجام پروژه‌های اعتبارسنجی موثق و مستند، نقش کلیدی در دریافت مجوزهای لازم و حفظ ایمنی محصولات دارد.

پیاده‌سازی استانداردها و استفاده از تکنولوژی‌های نوین مانند HPLC، LC-MS، ICP-OES و qPCR در کنار روش‌های کشت میکروبی دقیق، تضمین‌گر دقت و صحت در نتایج هستند. بخش‌های QC/QA که این داده‌ها را نظارت و تحلیل می‌کنند، باید به دقت به مستندسازی نتایج و بازنگری فرآیندها بپردازند تا ضمن پیشگیری از خطاها، روندهای اصلاحی و پیشگیرانه را پیاده کنند.

سوالات متداول

حد تشخیص (LOD) چیست و چرا اهمیت دارد؟

LOD کمترین غلظتی است که می‌توان حضور یک آنالیت را به طور قابل اطمینان تشخیص داد و برای اطمینان از حساسیت روش اهمیت دارد.

چگونه خطیّت یک روش آزمون ارزیابی می‌شود؟

خطیّت با تعیین رابطه‌ی مستقیم بین غلظت آنالیت و پاسخ دستگاه در بازه مشخصی سنجیده می‌شود.

تکرارپذیری چه تفاوتی با بازتولیدپذیری دارد؟

تکرارپذیری به تغییرات نتایج در شرایط یکسان و کوتاه‌مدت اشاره دارد، درحالی‌که بازتولیدپذیری تغییرات در شرایط متفاوت را مد نظر دارد.

چرا تعیین LOQ برای آزمایشات کاربردی اهمیت دارد؟

LOQ پایین‌ترین حدی است که می‌توان به طور کمی و دقیق آنالیت را اندازه‌گیری کرد و در کنترل کیفیت بسیار حائز اهمیت است.

چگونه می‌توان از اعتبارسنجی روش‌های آزمون در پروژه‌های ISO نهایت استفاده را برد؟

با مستندسازی کامل داده‌ها، اجرای آزمون‌های کنترل کیفیت (QC)، رعایت پیش‌نیازهای مدیریت کیفیت و آماده‌سازی برای ممیزی‌های داخلی و خارجی می‌توان به انطباق کامل با الزامات ISO دست یافت.

روش‌های میکروبیولوژیکی چگونه در تعیین تکرارپذیری موثر هستند؟

آزمون‌های کشت میکروبی و شمارش کلونی با توجه به حساسیت بالای این روش‌ها نیازمند اجرای دقیق نمونه‌برداری، محیط کشت استاندارد و آزمون تکراری هستند که تاثیر بسزایی بر تکرارپذیری نتایج دارد.